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Jun 14, 2023

Verwendung des Speckle-Imaging-Unterprogramms

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2613 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das Wachstum der Mikrobenkolonie wird durch die Aktivität der Zellen an den Rändern der Kolonie vorangetrieben. Dieser Vorgang ist jedoch nicht sichtbar, es sei denn, es wird eine spezifische Färbung oder ein Querschnitt der Kolonie durchgeführt. Die Speckle-Bildgebungstechnologie ist eine nicht-invasive Methode, die die Visualisierung der Zonen erhöhter mikrobieller Aktivität innerhalb der Kolonie ermöglicht. In dieser Studie wurde die Laser-Speckle-Bildgebungstechnik verwendet, um das Wachstum der Mikrobenkolonien aufzuzeichnen. Diese Methode wurde an drei verschiedenen Mikroorganismen getestet: Vibrio natriegens, Escherichia coli und Staphylococcus aureus. Die Ergebnisse zeigten, dass das Speckle-Analysesystem nicht nur das Wachstum der Mikrobenkolonie aufzeichnen, sondern auch die mikrobielle Wachstumsaktivität in verschiedenen Teilen der Kolonie visualisieren kann. Die entwickelte Speckle-Bildgebungstechnik visualisiert die Zone mit der „höchsten mikrobiellen Aktivität“, die vom Zentrum zur Peripherie der Kolonie wandert. Die Ergebnisse bestätigen die Genauigkeit der bisherigen Modelle des Koloniewachstums und liefern Algorithmen zur Analyse der mikrobiellen Aktivität innerhalb der Kolonie.

Das Wachstum der Koloniegröße wird als Kriterium zur Charakterisierung der mikrobiellen Aktivität auf Agarmedien verwendet. Das Wachstum der Koloniegröße wird normalerweise durch die Aufzeichnung von Livebildern zu unterschiedlichen Zeiten und den Vergleich der Koloniegrößen überwacht. Mithilfe dieser Bildgebungstechnik werden Bilder mit hochauflösenden Kameras oder Flachbettscannern1,2 erfasst. Kritische Nachweiszeit, Koloniegröße, Wachstumsrate und maximale Koloniegröße sind die Parameter, die mit den vorhandenen Live-Bildgebungsmethoden quantifiziert werden können.

Es gibt mehrere Modelle, die das Koloniewachstum beschreiben3,4,5. In vielen Modellen wird das Wachstum mikrobieller Kolonien als ungleichmäßig beschrieben – das Koloniewachstum hängt von den aktiven Zonen der Mikroben ab, die wiederum von der Nährstoffversorgung aus dem Medium abhängig sind. Beispielsweise ist das mikrobielle Wachstum am Rand der Kolonie aufgrund der ständigen Nährstoffzufuhr aus den umgebenden Medien oder des ständigen Drucks der Zellen auf die seitlichen Medien aktiver als in deren Mitte. Die mikroskopische Struktur der Kolonie stützt viele dieser Vermutungen. Die Zellen in der Mitte der Hefekolonie hören auf, sich zu vermehren, und verlieren ihre Lebensfähigkeit, während die Zellen am Rand derselben Kolonie am Leben sind und weiter wachsen (proliferieren)6. Die Unterschiede in der mikrobiellen Aktivität in verschiedenen Teilen der Kolonie können mit den vorhandenen Live-Bildgebungsmethoden nicht genau visualisiert werden. Derzeit können unterschiedliche mikrobielle Aktivitäten innerhalb von Kolonien nur mit invasiven Verfahren untersucht werden – Koloniequerschnitt und Lebensfähigkeitsfärbung6.

Ein Interferenzmuster, das durch kohärentes Licht entsteht, das von verschiedenen Teilen der beleuchteten Oberfläche reflektiert oder gestreut wird, ist ein Laserfleck. Wenn ein Objekt, das mit Laser-Speckles bestrahlt wird, seine Streueigenschaften im Laufe der Zeit nicht ändert, würde sich auch das Speckle-Bild nicht ändern. Wenn sich die Streuer spontan bewegen (z. B. Brownsche Bewegung), beginnen sich einige Flecken zu verändern (Form, Intensität). Die Änderung der Streueigenschaften von Objekten erzeugt einen zeitlich veränderlichen Speckle. Das heißt, äußere Ereignisse oder Einflüsse sowie direkt auf der gemessenen Oberfläche ablaufende Prozesse können zu Veränderungen der Speckle-Bilder führen7. Im Hinblick auf dieses Phänomen hat sich die Laser-Speckle-Bildgebungstechnik bei der Überwachung der mikrobiellen Aktivität in optisch inhomogenen Medien durch die Analyse zeitlich variierender Laser-Speckle-Muster als nützlich erwiesen.

Die Laser-Speckle-Bildgebungstechnik ist eine aufstrebende Technologie für medizinische und Lebensmittelsicherheitsanalysen. Es ermöglicht die Früherkennung von mikrobiellem Wachstum8, die Identifizierung von Pilzinfektionen in Apfelfrüchten9 und die Messung des peripheren Blutflusses bei Sklerose-Patienten10.

In dieser Studie wurde die Speckle-Bildgebungstechnik verwendet, um das Wachstum und die Strukturmerkmale der Mikrobenkolonie aufzuzeichnen. Die Ergebnisse zeigten, dass das entwickelte Speckle-Analysesystem nicht nur in der Lage ist, das Wachstum einer Mikrobenkolonie aufzuzeichnen, sondern auch die mikrobielle Wachstumsaktivität in den verschiedenen Teilen der Kolonie zu visualisieren. Die Speckle-Bildgebung zeigt, dass das Koloniewachstum eher durch die Zellproliferation an den Rändern als in der Mitte vorangetrieben wird. Die Ergebnisse bestätigen die Genauigkeit der bisherigen Modelle des Koloniewachstums und liefern Algorithmen für die Analyse der mikrobiellen Aktivität innerhalb der Kolonie.

In den Experimenten wurden folgende Mikrobenstämme verwendet: Escherichia coli ATCC® 8739 (E. coli), Vibrio natriegens DSM 759 (V. natriegens) und Staphylococcus aureus ATCC® 6538P (S. aureus). Bakterienkulturen wurden auf Agarplatten gehalten. E. coli und S. aureus wurden auf LB-Agarmedien bestehend aus Bacto Pepton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Agar 20 g/l (alle Biolife, Italien) und NaCl 5 g/l (Sigma, Italien) gehalten. Deuschland). V. natriegens wurde auf agarisierter NB-Salzbrühe bei Raumtemperatur gehalten: Difco Nutrient Broth 8 g/l, NaCl 15 g/l, wie von Weinstock et al.11 vorgeschlagen.

Alle Mikrobenarten wurden aus einer einzelnen Kolonie in den jeweiligen Flüssigmedien subkultiviert und über Nacht bei +30 °C kultiviert. Petrischalen wurden mit seriell verdünnter Bakterienkultur beimpft, um 20–200 Kolonien pro Platte zu ergeben. Petrischalen mit inokulierten Bakterien wurden bei +30 °C in einen Inkubator (Herracell 240-i, Thermo Scientific) gestellt. Das Koloniewachstum wurde parallel durch 635-nm-Laserbeleuchtung (siehe Beschreibung in „Experimentelles System zur Erfassung der Laser-Speckle-Bilder und Bilder unter Breitbandbeleuchtung“) und durch einen Flachbett-Dokumentenscanner (CanoScan 4400f, Canon) überwacht. Das automatische Scannen der Platten nach jedem 15- oder 30-Minuten-Intervall wurde durch Ausführen der Auto Clicker-App sichergestellt. Die Auflösung der Bilder betrug 600 DPI.

Das experimentelle Laser-Speckle-Bildgebungssystem wurde für die Aufnahme von Bildern im Makromaßstab unter Weißlicht-LED und roter Laserbeleuchtung aufgebaut. Das System besteht aus einer Multimode-Laserquelle, einer weißen LED-Lichtquelle, einem 35-mm-C-Mount-Objektiv @F18, einem optischen Abschwächer, einer Testagarplatte (mit inokulierten Bakterien) und einer CMOS-Kamera (Abb. 1). Laserflecken wurden durch einen linear polarisierten 635-nm-Multimode-Dioden-gepumpten Festkörperlaser (Ausgangsleistung bis zu 300 mW) mit einer Kohärenzlänge von 30 cm erzeugt. Der optische Abschwächer wurde verwendet, um die optimale Belichtung für die Bildaufnahme zu erreichen und Erwärmungseffekte der beleuchteten Platte zu vermeiden, wodurch eine Leistungsdichte des gestreuten Laserlichts von 3–5 mW/cm2 auf der gesamten Agarplattenoberfläche ermöglicht wurde. Der Durchmesser des Laserstrahls auf der Oberfläche betrug mehr als 9 cm und sorgte so für eine gleichmäßige Ausleuchtung der gesamten Standard-Petrischale. Die Hauptkomponenten des Systems sind in Abb. 1 dargestellt. Die Speckle-Bilder wurden von einer CMOS-Kamera in 30-s-Intervallen für Experimente mit unterschiedlicher Dauer (25–70 h) aufgenommen. Die Belichtungszeit wurde auf 1 s eingestellt; Es wurde entsprechend der Laserbeleuchtung und der Linsenblende ausgewählt. Parameter des optischen Aufbaus, einschließlich Kameraauflösung, Objektivblende, Kameraabstand zur Petrischale und der resultierende interessierende Bereich, wurden ausgewählt, um eine ausreichende räumliche Auflösung für die Erkennung von Laserflecken zu erreichen. Die Objektivvergrößerung wurde auf 0,2 eingestellt. Als optimales Gleichgewicht zwischen Bildschärfe, Fleckengröße und erforderlicher Belichtung wurde der Blendenwert F18 gewählt. Daraus ergibt sich eine Ortsauflösung von 9 μm und eine Specklegröße von 33 μm.

Experimenteller Arbeitsablauf zur Erfassung von Speckle-Bildern während des Bakterienwachstums. (A) Einzelkolonien-Inokulation auf ein LB-Medium und Kultivierung über Nacht (+ 30 °C). (B) Verdünnung und Inokulation der Übernachtkultur auf agarisierten LB-Medien. (C) Koloniewachstum auf Agarplatten im Thermostat + 30 °C mit Speckle-Bilderfassung unter 635-nm-Laser und Flachbettscanner. D Bildverarbeitung und Datenanalyse (MATLAB-Umgebung): Erkennung der Koloniegröße, Wachstumsgeschwindigkeit, Filterung des Speckle-Signals, Identifizierung der Speckle-Migration usw.

In früheren Studien beschrieben die Autoren eine empfindliche Korrelations-Subpixel-Analyse, die dabei helfen kann, bakterielle Aktivität und ihre Auswirkungen innerhalb einer Kolonie zu erkennen8,12. Das gesamte Versuchsfeld (Petrischale) wurde in kleine Abschnitte von N × N Pixeln unterteilt. Die folgenden Schritte wurden für jeden Abschnitt separat durchgeführt. Eine zweidimensionale normalisierte Kreuzkorrelation wurde zwischen aufeinanderfolgenden Bildern von N × N Pixeln vom Beginn bis zum Ende des Experiments durchgeführt13:

wobei a(x,y) und b(x,y) zwei benachbarte Frames in der Sequenz sind, \(\overline{a}\) und \(\overline{b}\) die Durchschnittswerte dieser beiden Frames sind, u und v sind räumliche Verschiebungen zwischen den Frames a(x,y) und b(x,y) in Richtung x bzw. y.

Es galt, die genaue Verschiebung des Kreuzkorrelationspeaks herauszufinden. Dieser Wert charakterisiert die Änderungen, die zwischen aufeinanderfolgenden NxN-Pixel-Bildern auftreten:

Um einen genaueren Wert des Versatzes zu ermitteln, wurde die parabolische Interpolation um den Spitzenwert der Kreuzkorrelationsfunktion14 herum durchgeführt:

wobei \({a}_{u}\) und \({b}_{u}\) die parabolischen Koeffizienten sind.

Die zwischen jedem Paar benachbarter NxN-Pixelbilder erhaltenen Versätze wurden vom Beginn bis zum Ende des Experiments akkumuliert:

Das Ausführen des beschriebenen Algorithmus für aufeinanderfolgende Bilder mit N × N Pixeln für die gesamte Sequenz erzeugt ein „Zeitsignal“.

Dieser Algorithmus wurde für alle N × N Pixelabschnitte im gesamten Versuchsfeld implementiert. Somit wurde anstelle des betrachteten Feldes des Experiments ein zweidimensionales Array aus den „Zeitsignalen“ erhalten, in dem die Zeit die dritte Dimension darstellt.

Um die lokalen Extrema zu finden und den Einfluss lokaler transienter Spitzen zu vermeiden, ist es sinnvoll, das Signal zu glätten15. Es wurde die Signalhüllkurvenfunktion verwendet (Abb. 2). Zu diesem Zweck kann eine Moving-Root-Mean-Square-Technik oder ein anderer ähnlicher Algorithmus verwendet werden:

Dabei ist N die Länge des Fensters, n das aktuelle Sample und k der im Fenster laufende Index. Dementsprechend ist N – die Länge des Fensters – für den Grad der Signalglättung verantwortlich. Um Ausreißer bei der RMS-Technik zu vermeiden, können die Extremwerte abgeschnitten werden, wie dies bei der Methode des abgeschnittenen Mittelwerts geschieht16.

Oben links: Das mit dem Algorithmus erhaltene Signal (blau) und seine Hüllkurve (rot). (Signal vom Koloniezentrum). Die grüne Linie zeigt den Zeitpunkt der maximalen Aktivität an. Die Abbildung zeigt ein Signal einer S. aureus-Kolonie. Ein ähnliches Speckle-Signalmuster wurde auch für E. coli und V. natriegens beobachtet. Unten links: Ein Spektrogramm ist eine Darstellung eines Signals im Zeit-Frequenz-Bereich unter Verwendung einer Kurzzeit-Fourier-Transformation (STFT), die es ermöglicht, gleichzeitig das Verhalten des Signals und des Rauschens in Zeit und Frequenz zu beobachten. Rechte Seite: das mit dem Algorithmus erhaltene Rauschen (aus der Kolonie) (oben) und das Rauschspektrogramm (unten).

In Abb. 2 ist es auch möglich, das Signal (innerhalb der Kolonie) und das Rauschen (außerhalb der Kolonie) sowohl im Zeit- als auch im Frequenzbereich zu vergleichen. Das Signal ist viel höher als der Rauschpegel.

Zunächst wurde getestet, ob das etablierte Laser-Speckle-Bildgebungssystem keinen Einfluss auf das Wachstum mikrobieller Kolonien hat. Um dies zu überprüfen, wurde der vom Laser-Speckle-System geschätzte Koloniewachstumsradius mit den Ergebnissen verglichen, die mit der Referenzmethode – einem bekannten Flachbettscanner-Bildgebungssystem – erzielt wurden. Zu diesem Zweck wurden Mikroorganismen aus einer einzelnen Kolonie über Nacht subkultiviert, seriell verdünnt und dann entweder auf eine Petrischale geimpft, um Koloniebildungen aus einer einzelnen Zelle zu beobachten (ca. 20–200 Kolonien pro Platte), oder indem Flecken aus seriellen Verdünnungen darauf aufgetragen wurden Platten und so Makrokolonien zu erhalten. Mikro- und Makrokolonien auf einem Agarmedium wurden im selben Inkubator parallel unter einem Speckle-Imaging-System und auf dem Flachbettscanner (Canon Canoscan4400r) gezüchtet. Das Wachstum der Kolonien von V. Natriegens, E. coli und S. aureus wurde aufgezeichnet und ihre Speckle-Muster mithilfe eines Subpixel-Korrelationsalgorithmus analysiert (beschrieben in „Algorithmus der Speckle-Bildumwandlung in Zeitsignale“). Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt.

Dynamik des Koloniewachstumsradius im Zeitverlauf. Die Kolonieradien von E. coli, V. natriegens und S. aureus wurden durch Laser-Speckle-Bildanalyse (blau) oder unter Berücksichtigung von Bildern gemessen, die mit einem Flachbettscanner (Canon 4400, 600 DPI) aufgenommen wurden (rot).

Beim Vergleich des Wachstums der getesteten Kolonien wurden mit beiden Systemen sehr ähnliche Ergebnisse erzielt. Daraus lässt sich schließen, dass das etablierte Laser-Speckle-System keinen Einfluss auf das Wachstum mikrobieller Kolonien hat (siehe Abb. 3). Wir verglichen die radiale Wachstumsrate von Mikrobenkolonien, die unter einem Speckle-Bildgebungsgerät und innerhalb eines Flachbettscanners gezüchtet wurden, und die radiale Wachstumsrate unterschied sich nicht signifikant (t-Test, p > 0,05), siehe Ergänzungstabelle 1.

Darüber hinaus wurde analysiert, ob das Speckle-Signal der wachsenden Kolonie mit der Anzahl der Zellen in der Kolonie korreliert. Der Zeitpunkt des maximalen Signalwerts der Laser-Speckle-Bilder wurde mit der anfänglichen Zellzahl innerhalb der Makrokolonie verglichen (siehe Abb. 4). Der Zeitpunkt des maximalen Signalwerts ist definiert als der Zeitpunkt, an dem die Signalaktivität ihr Maximum erreicht. Die E. coli-Kultur über Nacht wurde seriell verdünnt und als Makrokolonien auf das LB-Agarmedium geimpft (das Volumen jedes Inokulums betrug 5 μl). Das Wachstum der Makrokolonie wurde mit einem Laser-Speckle-Bildgebungssystem aufgezeichnet. Der Zeitpunkt des maximalen Signalwerts für jede Makrokolonie wurde bestimmt und gegen die anfängliche Zellzahl pro Makrokolonie aufgetragen. Die Mittelwerte der Signalspitzenzeit und die Standardabweichung der drei unabhängigen Inokulationsreihen wurden berechnet (siehe Abb. 4).

Abhängigkeit des Zeitpunkts des maximalen Signalwerts (rote Linien in der Grafik links und blaue Kreise in der Grafik rechts), der vom Laser-Bildgebungssystem erhalten wurde, von der anfänglichen Anzahl der E. coli-Zellen in der Kolonie.

Die ersten Ergebnisse zeigten, dass das Koloniewachstum innerhalb eines Speckle-Bildgebungssystems das gleiche war wie in einem Flachbettscanner. Leichte Unterschiede zwischen ihnen ergeben sich aus dem individuellen Wachstum der Kolonie, das durch die Lokalisierung der Kolonie innerhalb der Platte oder den Abstand zu den nächsten Nachbarn beeinflusst werden kann17. Der Zeitpunkt des maximalen Signalwerts des Speckle-Signals hängt unterdessen von der anfänglichen Zellzahl innerhalb der Kolonie ab. Wenn die anfängliche Zellzahl in der Kolonie groß ist, ist weniger Zeit erforderlich, um das maximale Speckle-Signal zu erreichen. Wenn andererseits die anfängliche Anzahl an Zellen klein ist, dauert es länger, bis der maximale Speckle-Signalwert erreicht wird. Auch wenn das Koloniewachstum länger als 20 Stunden andauert (siehe Abb. 4 für E. coli), wird das Maximum des Speckle-Signals einmal erreicht und es „erholt sich nie wieder“.

Das durch Subpixelkorrelation von Laser-Speckle-Bildern erhaltene Signal, das die Bakterienaktivität charakterisiert, nahm innerhalb der Kolonie zu, erreichte sein Maximum und nahm dann ab. Die Signalstärke wies eine bemerkenswerte räumlich-zeitliche Verteilung auf. Verschiedene Teile der Kolonie hatten unterschiedliche maximale Signalspitzenzeiten. Der maximale Aktivitätspeak wurde zunächst im Zentrum der Kolonie beobachtet. Im Laufe der Zeit wanderte die Aktivitätswelle vom Zentrum zu den Rändern der Kolonie (siehe Abb. 5 und 6). Dieses räumlich-zeitliche Verhalten des Speckle-Signals wurde in allen getesteten Mikrobenkolonien beobachtet: S. aureus, E. coli und V. natriegens. Obwohl eingehende Analysen zur Struktur der Speckle-Signalmigration an mehreren Kolonien von drei verschiedenen Mikrobenarten (V. natriegens, E. coli und S. aureus) durchgeführt wurden, ist die Signalmigration vom Zentrum zum Rand der Kolonie weg Merkmal jeder einzelnen Mikrobenkolonie. In der ergänzenden Abbildung zeigt S1 ein Beispiel eines Teils einer Petrischale mit etwa 25–30 Kolonien. Jede der Kolonien zeigt nach der Subpixel-Korrelationsanalyse die Bildung des oben beschriebenen Aktivitätsringeffekts.

Raumzeitliche Verteilung des Speckle-Signals in der S. aureus-Kolonie. Obere Reihe: Signaldynamik über die Zeit an verschiedenen Punkten innerhalb der Kolonie (weißer Stern in den mittleren Diagrammen). Die grüne Linie markiert die maximale Aktivität, danach nimmt das Signal ab. Mittlere Reihe: Veränderungen der Aktivität während des Koloniewachstums. Untere Reihe: Rohe Speckle-Bilder.

Der Zeitpunkt der höchsten Aktivität der Kolonie (Beginn der Aktivitätsabnahme) während des Wachstums der S. aureus-Kolonie. Oberes Bild – ein zweidimensionales räumlich-zeitliches Bild; unteres Bild – die Spitzenaktivität als Funktion der Zeit. Ein ähnliches räumlich-zeitliches Verhalten des Signals wurde auch in Kolonien von E. coli und V. natriegens beobachtet.

Es ist möglich, ein Bild zu erhalten, das den Beginn des Rückgangs der Aktivität in der gesamten Kolonie veranschaulicht (siehe Abb. 6, oberes Bild), indem man die Zeitpunkte des Beginns des Rückgangs über die gesamte Fläche der Kolonie wählt und sie auf a platziert zweidimensionale räumliche Karte mit den entsprechenden Koordinaten.

Der hochaktive „Ring“ bildet sich um das Zentrum und wandert dann zusammen mit der Vorderseite der wachsenden Kolonie weg. Die Farbe zeigt den Zeitpunkt (in Stunden) an, zu dem die Aktivität abzunehmen begann: Die blaue Farbe (in der Mitte) stellt den frühesten Zeitpunkt dar, die rote Farbe den spätesten Zeitpunkt (Rand der Kolonie).

Der Ort der ersten Abnahme auf der Karte kann als Ausgangspunkt für das Wachstum einer Mikrobenkolonie angenommen werden. Wenn man die Koordinaten dieses Startpunkts oder Zentrums kennt, ist es möglich, eine Kurve des Koloniewachstums als Funktion der Zeit zu erhalten. Da das Wachstum der Kolonie jedoch von verschiedenen Faktoren abhängt (Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen, Brownsche Bewegung, Push und/oder Pull von benachbarten Zellen innerhalb der Kolonie, Asynchronität des Zellwachstums und der Zellproliferation innerhalb der Kolonie usw.) Die resultierende Kurve wird eine gewisse Wertestreuung aufweisen (Abb. 6, unteres Diagramm). Daher wurde ein gleitender Medianfilter auf die Glättung der Kurvendaten angewendet15:

Dabei ist N die Länge des Fensters und n das aktuelle Sample. Der Median ist die Zahl, die bei aufsteigender Sortierung in der Mitte einer Zahlenmenge liegt. Das heißt, die Hälfte der Elemente in der Zahlenmenge ist nicht kleiner als der Median und die andere Hälfte ist nicht größer als der Median:

Diese Methode wurde aus folgenden Gründen angewendet: (1) Es wird nicht versucht, die Kurve in eine bestimmte Form zu bringen: eine gerade Linie oder eine Parabel usw. (2) Im Gegensatz zu einem gleitenden Durchschnitt werden Ausreißer nicht berücksichtigt .

Der „Ring“-Effekt wurde für alle drei Arten der getesteten Bakterien erzielt. Der Hauptunterschied, der beobachtet wurde, war die Wachstumsrate (Abb. 7).

Kurven der Spitzenaktivität der Kolonien als Funktion der Zeit für 3–4 V. natriegens (blau), E. coli (rot) und S. aureus (grün) Kolonien.

Nimmt man die Punkte, die dem Abstand vom Mittelpunkt der Kolonie entsprechen, gemäß der in den Abbildungen beschriebenen Kurve. 6 und 7 werden die Koordinaten im Raum (x, y) für jeden „Ring“ ermittelt. An jedem dieser Punkte im Raum wird eine geglättete Hüllkurvenfunktion des Signals platziert (Abb. 5). Somit entsprechen viele Signale jedem spezifischen Radius (der Entfernung vom Zentrum der Kolonie zum Punkt maximaler Aktivität). Im Idealfall wären alle Signale innerhalb desselben „Rings“ (im gleichen Abstand vom Koloniezentrum) gleich. Das Wachstum einer Bakterienkolonie wird jedoch durch die verschiedenen oben genannten Bedingungen beeinflusst, sodass diese Signale leicht unterschiedlich sind. Daher ist es notwendig, eine Mittelung aller Signale für einen bestimmten Radius vorzunehmen, damit jeder Radius ein Signal erhält, das ihn charakterisiert. Eine solche Mittelung wurde unter Anwendung der Methode des abgeschnittenen Durchschnitts durchgeführt16, wobei die Abschneidung nicht in der Amplitude, sondern in der Zeit des Aktivitätspeaks durchgeführt wurde:

Dabei ist L die Anzahl der Hüllkurvensignale in einem bestimmten Abstand, \({k}_{b}\) und \({k}_{f}\) – die Anzahl der Hüllkurvensignale, die von jeder Seite abgeschnitten wurden. Das heißt, diejenigen Signale, deren Aktivitätsspitze im gegebenen Radius stark vom allgemeinen Trend abwich (verfrüht oder verzögert), wurden nicht berücksichtigt. Die erhaltenen gemittelten Signale wurden als Funktion der Entfernung vom Zentrum und der Zeit kartiert (Abb. 8, oberes Bild).

Hüllkurven der gemittelten Signale als Funktion der Entfernung vom Zentrum der Kolonie und der Zeit (oben) und der Höhepunkt der Aktivität als Funktion der Entfernung vom Zentrum der Kolonie für verschiedene Zeiten (unten) von S. aureus. Ein ähnliches räumlich-zeitliches Verhalten des Signals wurde auch in Kolonien von E. coli und V. natriegens beobachtet.

Durch die Auswahl mehrerer Zeitpunkte auf der Karte kann beobachtet werden, wie der Höhepunkt der Aktivität in Abhängigkeit von der Entfernung vom Zentrum der Kolonie aussieht. Die Breite des Peaks ist proportional zur Breite des Aktivitätsrings und seine zeitliche Änderung ist im unteren Diagramm von Abb. 8 dargestellt.

Die räumliche Breite des Signals zu verschiedenen Zeiten kann in Abb. 8 beobachtet werden. Die Signalbreite entspricht der Abnahme vom Spitzenwert auf einen bestimmten Wert. Wenn es kein Rauschen, keine unerwünschten Signale oder andere Faktoren gäbe, wäre das Kriterium einfach: Reduzierung des Signalpegels oder seiner Leistung vom Maximalwert auf Null. Unter realen Bedingungen sollte es jedoch einen gewissen Schwellenwert geben, ab dem das Signal noch vom Rauschen unterscheidbar ist. Als Kriterium wurde die Abnahme der Signalleistung vom Maximum auf 1/3 des Maximalwertes gewählt. Das heißt, es ist zu beachten, dass die tatsächliche Breite etwas größer ist als die empfangene. Es ist möglich, die Breite für jeden Moment zu ermitteln. Diese Breite entspricht der Breite des „Rings“ zum entsprechenden Zeitpunkt (siehe Abb. 9).

Bestimmung der Breite des Aktivitätsrings für die Kolonie S. aureus: (a) Signalwerte und ermittelte Breite des Aktivitätsrings (violette Linie), (b) die erhaltene Breite des Aktivitätsrings, (c ) Vergleich der erhaltenen Breite des Aktivitätsrings (schwarze Linien) für eine Kolonie zu verschiedenen Zeiten. Ein ähnliches räumlich-zeitliches Verhalten des Signals wurde auch in Kolonien von E. coli und V. natriegens beobachtet.

Aus Abb. 9a,b ist ersichtlich, dass die Änderung der Ringbreite zwar gering ist, aber mit einigen Abweichungen als konstant angesehen werden kann. Das heißt, von dem Zeitpunkt an, als es möglich war, mit der Beobachtung des „Rings“ zu beginnen, und bis zum Ende der Beobachtung, als der „Ring“ verschwand, blieb die Breite des „Rings“ ungefähr unverändert (mit Vorbehalten hinsichtlich der Genauigkeit der Messung). , zufällige Phänomene im Verhalten einer Kolonie vieler Mikroorganismen, Lärm usw.). Das für eine ausgewählte Kolonie beschriebene Verhalten wurde für alle in dieser Studie berücksichtigten Bakterienarten beobachtet. Die Breite des „Rings“ ist bei jeder Bakterienart unterschiedlich. Abbildung 10 zeigt die Breite des „Rings“ für alle Arten von Bakterienkolonien. Die erhaltenen Ergebnisse entsprechen dem von John Pirt eingeführten mathematischen Modell des mikrobiellen Koloniewachstums („Pirt-Modell“)5.

Die Breite des Aktivitätsrings als Funktion der Zeit für verschiedene Bakterienkolonien; (a) Breite des Aktivitätsrings, bestimmt durch die Speckle-Methode; (b) berechnete „Ring“-Breite unter Verwendung des Pirt-Modells (Gleichung 9). Parameter: Alpha und r für das Modell werden ebenfalls aus Speckle-Experimenten ermittelt. Jede Kurve zeigt die Breite des Aktivitätsrings über die Zeit einer Kolonie eines bestimmten Bakterientyps.

Die Pirt-Studie5 liefert eine Formel zur Berechnung der Breite der aktiven Zone bzw. des „Rings“:

Dabei ist ω die Breite der aktiven Zellproliferationszone der Kolonie, r der Kolonieradius zum Zeitpunkt t und \({r}_{0}\) der Radius zum Zeitpunkt t = 0; α ist die spezifische Wachstumsrate, auch bekannt als (μ, h−1), die aus der Gompertz-Gleichung8,17 ermittelt werden kann. Mit den experimentellen Daten (dem Radius des Koloniewachstums, der entsprechenden Zeit und μ) ist es somit möglich, die Breite der aktiven Zone oder die Breite des „Rings“ mithilfe von Gl. zu berechnen. (9). Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse und das Pirt-Modell werden in Abb. 10 verglichen.

Das Gesamtmuster der Ringbreite ist für jede Bakterienart einzigartig und einheitlich. Allerdings kann sich die Dynamik der Aktivitätsringbreite jeder Kolonie einer Mikrobenart zeitlich verschieben. Bei länger wachsenden Kolonien bleibt die Proliferations- und damit Speckle-Aktivität der Kolonie länger erhalten. Es kann angenommen werden, dass dies mit der Verteilung der Kolonien auf der Platte zusammenhängt. Da die Bakterienkolonien auf den Agarplatten zufällig verteilt waren, wurde ihr Wachstum durch die benachbarten Mikrobenkolonien beeinflusst. Das Wachstum von Mikrobenkolonien wird stark durch benachbarte Kolonien in der Nähe beeinflusst. Je mehr benachbarte Kolonien eine bestimmte Kolonie hat, desto früher stoppt ihr Wachstum aufgrund der Erschöpfung der gemeinsamen Nährstoffressourcen der Medien18,19.

Das Pirt-Modell sagt voraus, dass der aktiv wachsende Rand der Mikrobenkolonie eine ähnliche Breite haben könnte, wie durch die Speckle-Aktivität gemessen (vergleiche Abb. 10. V. natriegens a und b), während es die Breite des aktiven Randes der Mikrobenkolonie überschätzt mikrobielle Kolonie im Fall von E. coli und S. aureus. Es kann vermutet werden, dass die Unterschiede auf die Tatsache zurückzuführen sind, dass die Wachstumsrate α, h−1 in der Pirt-Gleichung eine Konstante ist, während sie sich während des Koloniewachstums tatsächlich ändert (abnimmt)4. Ein weiterer zu berücksichtigender Aspekt ist, dass in beiden Fällen experimentelle Daten für die Berechnungen verwendet wurden. Allerdings hat Rauschen, wie oben erwähnt, die Messgenauigkeit beeinflusst.

Das Wachstum mikrobieller Kolonien auf dem Agarmedium ist eine Technik, die in der Mikrobiologie in der Forschung und bei Routinetests zur Analyse der mikrobiellen Kontamination von Umwelt-, Lebensmittel- oder medizinischen Proben eingesetzt wird. Viele mathematische Modelle werden verwendet, um das Wachstum mikrobieller Kolonien zu beschreiben4,5,18,20. Die Breite der äußersten Aktivitätszone – „der Ring“ der Kolonie – wird häufig in die mathematischen Modelle einbezogen, um die Berechnung der Dynamik des Koloniewachstums zu vereinfachen (linearisieren)5,21. Es liegen jedoch nur wenige experimentelle Daten über die tatsächliche Größe der Aktivitätszone der wachsenden Kolonie vor.

Das Pirt-Modell des mikrobiellen Koloniewachstums gehört zu den ersten Modellen, die das radiale Wachstum mikrobieller Kolonien im Laufe der Zeit beschreiben. Das Modell stimmt gut mit realen Beobachtungen überein, wenn es keine Wachstumshemmung durch die benachbarten Kolonien gibt und die Größe der Aktivitätszone am Rand konstant ist. Das Pirt-Modell wurde an entfernt wachsenden Makrokolonien validiert, die aus vielen Zellen entstehen5. Bei Routinetests von Umwelt- oder medizinischen Proben werden jedoch typischerweise Mikrokolonien beobachtet, die in zufälligem Abstand zu den benachbarten Kolonien wachsen22. Darüber hinaus wachsen ihre Kolonien aufgrund der genomischen oder physiologischen Zusammensetzung mikrobieller Arten in unterschiedlichen 3D-Formen (kuppelförmig, flach usw.), was wiederum die Breite der Aktivitätszone am Rand der Kolonie beeinflussen kann23 .

In einem der jüngsten von Warren et al.24 vorgeschlagenen Modelle bestimmt die Ausrichtung der mikrobiellen Zellen (horizontal oder vertikal) zusammen mit der allmählichen Nährstoffverarmung um die Kolonie herum die Dynamik des Koloniewachstums. Warren und Kollegen bemerkten in ihren Simulationen die Bildung einer metabolisch aktiven „Ring“-Struktur um die Kolonie, die von Zellen gebildet wird, die direkten Kontakt mit dem Substrat haben und in der die meiste Proliferationsaktivität stattfindet24.

In dieser (unserer) Studie wurde ein auf Laser-Speckle basierendes System zur Aufzeichnung des mikrobiellen Koloniewachstums zusammen mit einem Subpixel-Korrelationsanalysealgorithmus von Laser-Speckle-Bildern entwickelt, der die Unterscheidung und Quantifizierung von Aktivitätszonen innerhalb der Kolonie ermöglicht. Das Speckle-Signal korreliert gut mit der Koloniewachstumsrate und ist abhängig von der Zellzahl pro Kolonie (siehe Abb. 3 und 4).

Es wird eine gewisse Streuung der durch die Speckle-Bildgebung erfassten Parameter (Breite des Aktivitätsrings, maximale Migrationsentfernung vom Zentrum, Wachstumskurven der Mikrobenkolonien) beobachtet, die möglicherweise auf Änderungen der Eigenschaften des Agarmediums, die biologische Variabilität der Probe und/oder zurückzuführen sind. oder Genauigkeit der Messungen.

Es ist bekannt, dass Agarplatten während der mikrobiellen Kultivierung dazu neigen, Wasser zu verlieren (auszutrocknen)25. Die Bildung und Stärke des Speckle-Signals kann durch das Austrocknen des Agarmediums beeinträchtigt werden. Nach unseren Beobachtungen können in vielen Experimenten in den ersten 3–5 Stunden Effekte im Zusammenhang mit dem Austrocknen der Agarmedien auftreten. Allerdings: (1) Dieser Effekt breitete sich wie eine „Welle“ in der Petrischale aus und verschwand dann, ohne weitere Effekte hervorzurufen. (2) Der beobachtete Effekt des „Trocknens“ trat viel früher auf als die Bildung von „Ringen“. Selbst wenn also eine Trocknung auftrat, hatte dieser Effekt keinen Einfluss auf die Bildung von Ringen. Ein Beispiel für den Trocknungseffekt ist in Abb. 11 dargestellt. Außerdem haben Sandle et al. beobachteten einen größeren Gewichtsverlust gleich zu Beginn (0–4 Stunden) der Kultivierung als am Ende.

Speckle-Bildgebung des Trocknungsagars (Agarmedium ohne Bakterien) in einer Petrischale.

Das Wachstum der Kolonien auf dem Agarmedium war ähnlich, nachdem die Inokulationskolonien dazu tendierten, die gleiche Anfangswachstumsrate aufzuweisen (siehe Abb. 3) und ihr Wachstum später voneinander abwich: Die Kolonien hörten zu unterschiedlichen Zeiten auf zu wachsen. Da die Zuteilung der Kolonien auf der Platte zufällig erfolgte und die Anzahl benachbarter Kolonien schwankte, konnte die Erschöpfung der Ressourcen und der anschließende Wachstumsstopp für jede Kolonie zu unterschiedlichen Zeiten erfolgen. Dennoch wies jede Kolonie einen Aktivitätsring mit einer charakteristischen Wanderung vom Zentrum weg auf, die mit der Zeit aufhörte, wenn das aktive Wachstum nachließ (siehe Abb. 12).

Das Aktivitätsringsignal hört mit der Zeit in alternden Kolonien von Vibrio natriegens auf. Oben: Kolonie-Speckle-Bilder, Unten: Bild nach Anwendung des Subpixel-Korrelationsalgorithmus, Aktivitätsstopp-Ring.

Wenn eine Kolonie nicht mehr aktiv ist, ist sie auf rohen Speckle-Bildern immer noch sichtbar (Abb. 12 (oben)), weist jedoch keinen Ringeffekt mehr auf (Abb. 12 (unten)). Daher wird der Schluss gezogen, dass es sich bei „Ringen“ weder um zufällige Phänomene im Zusammenhang mit der Agar-Austrocknung noch um Artefakte des Kolonierands handelt, sondern um ein Signal mikrobieller Aktivität, das verschwinden würde, wenn die Kolonie aufhört zu wachsen.

Die vorgeschlagene Speckle-Technik ermöglicht die Identifizierung und Aufzeichnung der Dynamik der Breite der Aktivitätszone während des Wachstums der Mikro- und Makrokolonie. In Zukunft könnte die Aufzeichnung des Koloniewachstums mithilfe des Laser-Speckles zu einem attraktiven, nicht-invasiven Instrument zur Quantifizierung der Wachstumsdynamik und Proliferationsaktivität mit Subkolonienauflösung werden.

Die Speckle-Bildgebungsmethode liefert mehr Einblicke in die mikrobielle Aktivität innerhalb der Kolonien als Standard-Bildgebungsserien unter Weißlicht.

Es wurde gezeigt, dass die Laser-Speckle-Bildgebungstechnik eine wirklich nicht-invasive Methode ist, die es ermöglicht, das ununterbrochene mikrobielle Koloniewachstum zu überwachen (die Wachstumsrate der Kolonien unter dem Speckle-System war statistisch nicht vom mikrobiellen Wachstum unter Referenzbedingungen zu unterscheiden). Nach Anwendung des Subpixel-Korrelationsalgorithmus („Algorithmus zur Umwandlung von Speckle-Bildern in Zeitsignale“) war die maximale Auftrittszeit des Speckle-Signals proportional zur Zellzahl in der Kolonie (Abb. 4).

Eine empfindliche Korrelations-Subpixelanalyse ergab, dass es innerhalb der Kolonie unterschiedliche Aktivitätszonen gibt, die während des Wachstums der Kolonie von der Mitte zu den Rändern wandern. Wir beobachteten ein ähnliches Muster der Aktivitätszonenwanderung („Ring“) in den Kolonien von drei verschiedenen Mikrobenarten. Darüber hinaus beobachteten wir das Vorhandensein des Rings in jeder aktiv wachsenden Kolonie (siehe ergänzende Abbildung S1). Die Migrationsgeschwindigkeit des „Rings“ variierte zwischen verschiedenen Mikrobenarten und spiegelte somit deren unterschiedliche Wachstumsraten wider, die für jede dieser Arten typisch sind.

Speckle-Bildgebung ist eine vielversprechende, leistungsstarke Technologie, die erstmals dazu beigetragen hat, Aktivitätszonen innerhalb der Mikrobenkolonie sichtbar zu machen. Zuvor wurde das Vorhandensein dieser Zonen mathematisch vorhergesagt. Die aktuelle Studie weist auch auf mögliche Wege zur Weiterentwicklung der Speckle-Bildgebungstechnologie für mikrobielle Koloniestudien hin: Erhöhung der Empfindlichkeit optischer und elektronischer Systeme zur Speckle-Erkennung, Minimierung von Rauschen und Suche nach Optionen für die Multiplexierung der Technologie. Dies würde es ermöglichen, die mikrobielle Proliferationsaktivität so früh wie möglich aufzuzeichnen, langsam wachsende Kolonien zu erkennen und die mikrobielle Aktivität innerhalb der Kolonie zu identifizieren, wodurch die vorgeschlagene Technik für viele direkte Anwendungen in Forschung und Entwicklung, Medizin und Epidemiologie geeignet wäre.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wird durch das EFRE-Projekt „Schnelles und kostengünstiges auf maschinellem Lernen basierendes System zur Analyse des Wachstums von Mikroorganismen“ (Vereinbarung Nr. 1.1.1.1/19/A/147) finanziert.

Fakultät für Informatik und Informationstechnologie, Abteilung für Computersteuerung und Computernetzwerke, Technische Universität Riga, Zunda Krastmala 10, LV-1048, Riga, Lettland

Ilya Balmages & Dmitrijs Bliznuks

Laboratorija Auctoritas Ltd, Čiekurkalna 1. linija 11, Riga, LV-1026, Lettland

Ilya Balmages, Ernests Tomas Auzins und Edgars Baranovics

Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie, Universität Lettland, Jelgavas str. 1, Riga, LV-1004, Lettland

Janis Liepins und Ernests Tomas Auzins

Institut für Atomphysik und Spektroskopie, Universität Lettland, Jelgavas str. 3, Riga, LV-1004, Lettland

Ilze Lihacova und Alexey Lihachev

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Nachdrucke und Genehmigungen

Balmages, I., Liepins, J., Auzins, ET et al. Verwendung der Speckle-Imaging-Subpixel-Korrelationsanalyse zur Aufdeckung eines Mechanismus des mikrobiellen Koloniewachstums. Sci Rep 13, 2613 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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Eingegangen: 29. August 2022

Angenommen: 10. Februar 2023

Veröffentlicht: 14. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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